HIV resistente a edição genética, mais uma barreira.

Gene-Therapy

Edição genética funciona mas falha (?).

Edição genética era a esperança na mente de muitos soropositivos, porém, novos estudos mostram que não vai ser tão “fácil” fácil assim se livrar do vilão causador da AIDS, o HIV. A edição genética funciona, mas a capacidade do vírus de mudar-se e criar resistência também.


Por Gus Caims/ Adaptado por Derek.

Ir para:

O estudo

Resultados e implicações

Referências

 

CRISPR/cas9

Um passo para trás para uma nova abordagem de cura do HIV, cientistas envolvidos em uma técnica que usa enzimas para remover gene viral do DNA de células infectadas descobriram que o HIV rapidamente desenvolve resistência às moléculas guia que têm como alvo a parte correta da sequência de DNA. Os vírus resistentes que retornam podem em alguns casos replicar de forma ainda mais rápida do que os vírus não expostos à terapia genética (apesar de ainda sofrerem com a ação de antiretrovirais convencionais).

Além disso, os cientistas sugerem que, a maneira pela qual a terapia genética funciona pode até mesmo promover o surgimento de resistências, pois ativamente cria pequenas mutações no local onde recorta o DNA celular. A resistência surge rápido – depois de 8 a 10 dias do início dos efeitos da terapia.

Isto não significa que a abordagem inteira está fadada ao fracasso, mas significa que a enzima de degradação genética  precisaria se ligar a uma variedade de locais do gene, desenhados detal maneira a se conectar a diferentes pontos do DNA viral escondido dentro do DNA de células humanas.

A tecnologia envolve o transporte de enzimas degradantes de DNA chamadas de CRISPR ou cas9 para dentro do coração do núcleo de células humanas. A enzima cas9 (encontrada primariamente em bactérias como defesa natural contra virus) se liga a um certo ponto de um fio único do “RNA guia” (sgRNA) que leva o cas9 para o ponto específico do DNA vampiro que precisa ser removido.

O conceito não é muito dissimilar à versátil terapia genética chamada de RNA de curta interferência (siRNA – short interference RNA), que está sendo investigada para uma certa quantidade de doenças, incluindo a hepatite B crônica. Mas enquanto a siRNA mira e degrada o RNA mensageiro e componentes moleculares que agem como o maquinário de replicação viral dentro do citoplasma das células, o sgRNA/cas9 mira no DNA integrado, o “modelo mestre” para produção viral que retrovírus como o HIV inserem dentro das instruções genéticas do coração das células e que existe no núcleo, não no citoplasma.

O estudo

Neste estudo in-vitro, os pesquisadores infectaram células de proteção CD4 com três diferentes sondas genéticas sgRNA/cas9 feitas para alcançar diferentes seções de DNA de HIV integrado. Um, chamado de T4, se ligou à área gag/pol do genoma do HIV, que inclui a máquina de cópia do HIV, a segunda, T10, se ligou a área chamada env/rev, que inclui as instruções para fabricação de envelope viral. Nestes dois casos o sgRNA se ligou a um ponto específico no DNA viral e cortou o mesmo, permitindo que o cas9 degradasse as pontas desgastadas.

sgRNA

Um mecanismo de reparação molecular intracelular chamado NHEJ (junção de ponta não-homóloga) por fim reparou as pontas desgastadas do DNA, mas este processo é inclinado a dar erros de cópia e introduz mudanças, inserções e exclusões dentro da cadeia de DNA – estas inserções e exclusões têm culpa no desenvolvimento de resistências, como veremos a seguir.

A terceira sonda genética, chamada de LTR-B, foi similar à publicada no final de março. Esta corta o DNA em dois pontos, que estão localizados perto das sequências chamadas de LTRs, que representam os pontos finais do material genético. Assim garante a completa remoção de todo o material genético da célula.

Uma implicação deste processo é que se a célula continuar capaz de produzir HIV, pode ser porque o DNA do HIV sofreu mutação de forma a se resistente à conexão com o sgRNA, e não porque ainda possa restar algum DNA que ainda seja capaz de produzir vírus infeccioso.

Resultados e implicações

A produção de partículas virais foi comparada entre células tratadas com sgRNA/cas9 e as tratadas somente com cas9. Os pesquisadores descobriram que, como já era esperado, a reprodução viral no início foi severamente prejudicada nas células infectadas com a sonda genética sgRNA/cas9. O auge de produção viral foi 83% menor nas células tratadas com T4, 95% nas tratadas com T10, e por volta de 98% nas tratadas com LTR-B.

A produção viral iniciou em torno de cinco dias depois da infecção em células controle mas foi adiado em aproximada mente 4 dias nas tratadas com LTR-B e em torno de 10 dias nas tratadas com T4 ou T10. Houve, no entanto, significante produção viral e, enquanto em células LTR-B o pico nos níveis virais de produção – que também foi retardado em 4 dias – era mesmo assim 55% menor do que em células controle, nas tratadas com T10 era exatamente o mesmo que nas células controle, mesmo sendo retardado em 8 dias, e ficou 20% maior nas tratadas com T4. Isto sugere que um desenvolvimento rápido de mutações estava em andamento.
Resistência ao cas9
Os pesquisadores fizeram outro experimento nas células infectadas com os vírus tirados no pico de produção viral do experimento anterior, que supostamente eram todos resistentes. Os vírus resistentes tratados com T4 produziram novamente 20% mais vírus do que células controle e no caso de células com T10, elas produziram a mesma quantidade de vírus do que células controle, porém , atingiram seu pico de produção viral seis dias antes. O que dá a entender que o HIV que havia se tornado resistente a T4 ou T10 era pelo menos tão eficaz em sua reprodução que o vírus controle, ou mais eficaz.

No caso dos resistentes a LTR-B, o auge na produção viral também foi alcançado em torno de seis dias antes do que vírus controle mas os níveis de produção viral permaneceram 30% menores sugerindo que vírus resistentes a LTR-B podem pagar um pequeno preço reprodutivo por sua resistência.

Nos vírus resistentes a T4, houve uma mutação de ponto único predominante (mutação com somente uma ‘letra’ trocada). Isto representou 81% dos vírus resistentes, e outra mutação de ponto único em 13% deles. Houve uma pequena quantidade de inserções e exclusões. Nos vírus resistentes a T10, enquanto uma mutação de ponto único representou 38% das mutações, os outros vírus tinham em geral mutações mais complexas de 3 ou 4 pontos de mudança.

A resistência observada nos LTR-B foi mais intrigante. O T4 e T10 removeu apenas uma pequena parte do genoma viral; assim se for reparado com imprecisão pode criar variantes resistentes. Neste caso é a ferramenta reparadora NHEJ que junta as pontas desgastadas do DNA de forma imprecisa e é a causa principal da mutação. Mas o LTR-B deveria remover por completo o genoma viral, então o DNA viral não deveria sequer ter a chance de produzir vírus mutantes. De onde então vinha a resistência?

Os pesquisadores descobriram que uma pequena proporção dos virus resistentes a T4 e T10, mas todos os resistentes a LTR-B, não apresentavam substituição de uma base genética por outra, como a maior parte dos vírus com resistência, mas sim tinham seções inteiras ou removidas ou inseridas no código genético – os chamados ‘indels’ (inserir/deletar).

Foi sugerido que o causador da resistência nestes casos seria o próprio sgRNA/cas9. O cas9 estaria translocando o DNA no local de corte de tal maneira que ele mesmo estava produzindo vírus resistentes.

Em outras palavras, neste caso a resistência não estava sendo causada por qualquer movimentação viral na presença de baixos níveis da droga, que exerceria uma pressão evolucionária –  estava sendo causado diretamente pela droga. Em suma, o sgRNA/cas9 estava atuando como um agente mutagênico, um impulsionador direto de mutação viral.

Algumas drogas antivirais pouco convencionais agem como mutagênicos, como a ribavirina, mas neste caso atuam no genoma viral. siRNAs também podem introduzir mutações diretamente no DNA celular. Mas esta é a primeira vez que um tratamento proposto para tratamento do HIV foi visto diretamente contribuindo para a produção de mutações resistentes dentro do DNA proviral no coração das células.

Enquanto a produção de resistência poderia ser diminuída drasticamente pelo uso de sgRNAs múltiplos, como a pesquisa sugere, este estudo mostra bloqueios inesperados estão à espera no caminho para uma cura, e que novas técnicas de edição genética e outras envolvidas podem impor riscos por si próprias.

Referência

Fonte: aidsmap.com
Referência: Wang Z et al. CRISPR/Cas9-derived mutations both inhibit HIV-1 replication and accelerate viral escape. Cell Reports, 15, pages 1-9. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2016.03.042. April 2016.